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 流動相在1000ml容量瓶中放人35.1g高氯酸鈉、1.40g磷酸二氫鉀、7.0mL1mol/L氫氧化鉀和40ml甲醇，用水定容后，混勻。用1mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.2(為符合分析系統(tǒng)的要求，甲醇濃度可改變，以適于葉酸的流出時間)。色譜分析系統(tǒng)常用的是在室溫下操作的高壓液相色譜儀，裝有一(25～30)cm×4mm的不銹鋼柱，其中充填直徑為5～10μm的多孔硅或陶瓷微?；瘜W鍵合的十八烷基硅烷。流動相應保持一定的壓力和流速，以取得要求的分辨率(見下述系統(tǒng)適用性試驗)和適宜的流出時間。使用能在254nm處吸收紫外線的檢測器。系統(tǒng)適用Chemicalbook性溶液用每100ml中含2ml氫氧化銨和1g高氯酸鈉的水溶液作為溶劑，配制每ml各含1mg藥典級參比標準葉酸和藥典級甲酰四氫葉酸鈣的溶液。使用前通過一孔隙度≤1μm，的膜濾器過濾溶液。系統(tǒng)適用性試驗用色譜儀分離相同體積(可達25μl)的標準液的5個進樣，并按檢測步驟測定峰響應值。按公式100×(標準偏差/平均峰響應值)計算峰響應值的相對標準偏差，不得超過2%。用相同方式注射25μ1體積的系統(tǒng)適用性溶液。按色譜儀通用試驗用于R的公式計算甲酰四氫葉酸鈣和葉酸之間的分辨率系數(shù)，不得小于3.6(用特殊的柱時，減少流動相中的甲醇量可提高分辨率)。